一、?原理? 本試劑盒采用間接競爭ELISA方法檢測水產(chǎn)和雞肉等**樣本中的硝呋索爾，在微孔條上預(yù)包被上偶聯(lián)抗原，利用抗原與抗體的特異性免*化學(xué)反應(yīng)的原理來進(jìn)行的，樣本中的硝呋索爾和微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競爭抗硝呋索爾衍生物抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣品中的硝呋索爾含量與樣品的吸光度值呈反比，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出硝呋索爾含量。 ? 二、?試劑盒技術(shù)指標(biāo)： 試劑盒靈敏度：??0.1ppb 樣本檢測下限： **、蜂蜜???????? 0.2ppb 魚/蝦等水產(chǎn)品**因存在一定的干擾，檢測下限為0.3ppb 回收率： 魚/蝦水產(chǎn)**??? 90％±15％ 蜂蜜/雞肉/肝臟樣本? 80％±15％ 交叉反應(yīng)率： 硝呋索爾代謝物? 100％ 呋喃唑酮代謝物? ?0.1％ 呋喃妥因代謝物?0.1％ 呋喃西林代謝物?0.1％ ? 三、試劑盒組成 1．微量測試孔：96T/8孔 2．標(biāo)準(zhǔn)品液： 0ppb? 0.1 ppb  0.3ppb? 0.9ppb? 2.7ppb? 8.1ppb （1ml/瓶） 3．酶標(biāo)記物??????????????? 12ml 4．抗體工作液????????????? 7ml 5．底物緩沖液????????????? 7 ml 6．底物液????????????????? 7 ml 7．終止液?? ?????????????? 7 ml 8．20倍濃縮洗滌液???????? 50 ml 9．復(fù)溶液 ???????????????? 50 ml 10．15.1mg衍生化試劑 ? 四、?所用儀器、試劑 具備的儀器：? 微孔酶標(biāo)儀、打印機(jī)、均質(zhì)器 、氮氣吹干裝置、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平（感量0.01g） 微量移液器：? 單道20μl-200μl，100μl-1000μl、多道250μl 試???? ??劑：? 甲醇、氫氧化鈉、乙酸乙酯、正己烷、濃HCl、磷酸氫二鉀、鄰硝基苯甲醛、亞硝基鐵**鉀（K2Fe（CN）5?NO?3H2O）ZnSO4?7H2O ? 五、樣本前處理步驟 樣本處理前須知 處理任何樣本時，都必須注意： （a）實驗中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時要更換吸頭。 （b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進(jìn)行清潔，以避免污染干擾實驗結(jié)果。 樣本前處理需配制： 1．衍生化試劑 稱15.1mg鄰硝基苯甲醛加甲醇10ml溶解(濃度10mM) 2．C液：（供奶樣用）稱12.5g亞硝基鐵**鉀用去離子水定溶至100ml。 ?? ?? D液：（供奶樣用）稱29.8g **鋅用去離子水溶解定溶至100ml。 3．0.1M K2HPO4?稱22.8g K2HPO4?3H2O 加去離子水溶解定溶至1L 4．1M HCl取8.6ml濃HCl加水定溶至100ml。 5．1M NaOH稱取4g NaOH加水定溶至100ml。 樣本的處理 (a)?肉樣或魚蝦 用均質(zhì)器均質(zhì)樣本,接（d）的描述方法 (b)?奶樣 1. 取出5ml的奶樣本到玻璃離心管中,分別加入C液和D液各250μl。 2. 用振蕩器充分混合樣本,用恒溫離心機(jī)4000r/min以上離心10min(4-12℃).若沒有恒溫離心機(jī),則先將樣本降溫至大約8℃,然后離心。 3. 接(d)的描述方法 (c)?蜂蜜? 1. 取1±0.05g樣本到離心管中。 2. 加入4ml的去離子水溶解,再加入0.5ml 1M HCl和100μl衍生化試劑,充分振蕩。 3. 接(d)第2步描述方法 (d)接上面的方法 1. 取1±0.05g的均質(zhì)樣本(肉樣/魚蝦)、牛奶的離心上清液1.1ml（相當(dāng)1ml奶樣），分別加入4ml的去離子水，0.5ml 1M HCl和100μl衍生化試劑，充分振蕩。 2. 置于56℃環(huán)境中孵育（2h）。 3. 分別加入5ml 0.1M K2HPO4，?0.4 ml 1M NaOH和5ml的乙酸乙酯，充分振蕩30s； 4. 在室溫下（20-25℃）4000r/min以上離心10min。 5. 取出2.5ml的乙酸乙酯到另一潔凈容器中于50℃氮氣/空氣吹干。 ??? 6. 用1ml正己烷溶解干燥物，用1ml已稀釋好的復(fù)溶液充分混合；在室溫下（20-25℃）4000r/min以上離心10min。 7. 取50μl下層相用于分析。 樣本稀釋倍數(shù)：2 ? 六、操作步驟 1． 將試劑盒從冷藏環(huán)境中取出并將所需試劑從試劑盒取出，置室溫（20-25℃）平衡30min以上, 注意每種液體試劑使用前均須搖勻。 2． 按需要取出微孔條及板架，將不用的微孔板重新密封，保存于2-8℃，不要冷凍。 3． 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50μl /孔，然后加入抗體工作液50μl /孔，再振蕩混勻，用封板膜蓋板，室溫反應(yīng)30min。 4． 洗板4-5次，每次浸泡30秒，拍干。 5． 加入酶標(biāo)記物100μl /孔，用封板膜蓋板，室溫反應(yīng)20min。 6． 洗板4-5次，每次浸泡30秒，拍干。 ? 7．顯色：每孔加入底物緩沖液50μl，再加底物液50μl，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境避光顯色10min。 8．測定：每孔加入終止液50μl，輕輕振蕩勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（在20min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)），測定吸光度值。 ? 七、結(jié)果判定 以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以硝呋索爾標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ng/ml）的半對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中硝呋索爾實際濃度。 ? 八、注意事項 1．室溫低于20℃或試劑及樣本沒有回到室溫（20-25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。 2．洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。 3．混合要均勻，洗板要徹底，否則會出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。 4．反應(yīng)終止液為2M**，避免接觸皮膚。 5．將不用的微孔板放進(jìn)自封袋重新密封 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。 6．不要使用過了有效日期的試劑盒，不要使用不同批號試劑盒中的試劑。 7．顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之，0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.6時，表示試劑可能變質(zhì)。 8．該試劑盒比較好反應(yīng)溫度為25 ℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。 ? 九、儲藏條件和保質(zhì)期 儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存，不要冷凍。 保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見包裝盒